Composição química e concentração mínima bactericida de dezesseis óleos essenciais sobre Escherichia coli enterotoxigênica / Determination of minimum bactericidal concentration of sixteen essential oils on enterotoxigenic Escherichia coli

RESUMO Este trabalho teve por objetivo avaliar o efeito bactericida in vitro de dezesseis óleos essenciais sobre Escherichia coli enterotoxigênica (ETEC). Dentre os óleos essenciais estudados, três foram extraídos in situ por arraste a vapor e treze foram adquiridos comercialmente. Todos os óleos foram analisados por CG-EM e CG-DIC. A atividade bactericida foi avaliada pelo método de microdiluição utilizando-se caldo triptona de soja e microplacas de poliestireno de 96 poços, com posterior plaqueamento das culturas em ágar triptona de soja. Os óleos essenciais de Cinnamomum cassia e de Thymus vulgaris apresentaram concentração mínima bactericida (CMB) de 0,12% e 0,25%, respectivamente. Já os óleos comerciais de Syzygium aromaticum e Origanum vulgare apresentaram ambos CMB de 0,50% e os óleos extraídos in situ de Cymbopogon citratus e Origanum vulgare apresentaram ambos CMB de 1,00%. Os dezesseis óleos essenciais apresentaram composição química qualitativa e quantitativa distintas. As análises químicas dos óleos essenciais de Cinnamomum cassia e de Thymus vulgaris tiveram a presença majoritária de E-cinamaldeído (84,52%) e timol (50,89%). Conclui-se que os óleos de C. cassia e T. vulgaris foram os mais eficazes na inibição do crescimento in vitro dessa bactéria, a qual possui diferentes níveis de sensibilidade dependendo da composição química do óleo.

ABSTRACT This study aimed to evaluate the bactericidal effect in vitro of sixteen essential oils on enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC). Among the essential oils, three were extracted in situ by steam distillation and thirteen were purchased commercially. All oils were analyzed by GC-MS and GC-FID. The bactericidal activity was evaluated by the microdilution method using tryptone soy broth, and 96-well polystyrene microplates with subsequent plating of the cultures in tryptone soy agar. Cinnamomum cassia and Thymus vulgaris essential oils showed minimal bactericidal concentration (MBC) 0.12% and 0.25%, respectively. Both commercial oils of Syzygium aromaticum and Origanum vulgare showed MBC of 0.50% and the oils extracted in situ Origanum vulgare and Cymbopogon citratus showed both MBC of 1.00%. The sixteen essential oils pointed out distinct qualitative and quantitative chemical composition. Chemical analysis of Cinnamomum cassia and Thymus vulgaris oils had the predominant presence of E-cinnamaldehyde (84.52% ± 0.07%) and thymol (50.89% ± 0.31%). In conclusion, T. vulgaris and C. cassia oils were the most effective in inhibiting in vitro growth of this bacterium, which has different sensitivity levels depending on the chemical composition of the oil.

Adaptação e adaptação cruzada de Listeria monocytogenes aos compostos eugenol e carvacrol / Adaptation and Cross adaptation of Listeria monocytogenes to eugenol and carvacrol compounds

RESUMOA evolução de certos microrganismos permite sua rápida adaptação aos ambientes em constante mudança, desenvolvendo assim, tolerância ou resistência ao aumento de determinados estresses. O uso de compostos bioativos provenientes da flora nativa tem sido apontado como uma possível solução para os problemas de controle da resistência e proliferação bacteriana. Este trabalho visou verificar a adaptação e adaptação cruzada de L. monocytogenes, frente aos compostos fenólicos eugenol e carvacrol. A concentração mínima inibitória (CMI) dos compostos fenólicos foi determinada pela técnica de microdiluição em placas de 96 cavidades, em caldo TSB + 0,5% de Tween 80. As concentrações finais (%) obtidas foram: 0,06; 0,12; 0,24; 0,49; 0,98; 1,95; 3,9; 6,25; 12,5; 25; 50. A suspensão bacteriana padronizada foi inoculada nas cavidades das placas, as quais foram incubadas a 37°C por 24 horas com posterior leitura da absorbância a 620 nm e determinação da CMI. A adaptação das células de L. monocytogenes ao eugenol e carvacrol foi realizada com o cultivo das células em TSB + 0,06% de eugenol ou carvacrol à 37°C por 2 horas. A cultura foi então centrifugada e as células ressuspendidas e padronizadas em TSB. A seguir, realizou-se novamente a técnica de microdiluição em caldo. Os resultados obtidos demonstraram que L. monocytogenes apresentou adaptação e adaptação cruzada frente ao carvacrol e eugenol. A CMI do eugenol e carvacrol foi de 24%. A pré-exposição de L. monocutogenes a concentração sub-letal de 0,06% de carvacrol ou de eugenol aumentou sua resistência. A pré-exposição ao carvacrol promoveu a adaptação de L.monocytogenes a ele aumentando a CMI para 12,5%. Já para o eugenol a CMI passou para 25%. Quando submetidas à concentração sub-letal de eugenol, este promoveu a adaptação das células tanto ao carvacrol quanto ao eugenol, sendo a CMI de 12,5%. Os resultados obtidos demonstraram que L. monocytogenes apresentou adaptação e adaptação cruzada ao carvacrol e eugenol. O presente trabalho sugere estudos futuros ainda mais abrangentes quanto à potencialidade antimicrobiana destes compostos.

ABSTRACTSome microorganisms have evolved and therefore are able to rapidly adapt themselves to a constantly changing environment, thus developing tolerance or resistance to the increase of some specific stresses. The use of bioactive compounds from the native vegetation has been pointed out as a possible solution to the problems of control of bacterial resistance and proliferation. This work aimed to check the adaptation and cross adaptation of L. monocytogenes, towards the phenolic compounds eugenol and carvacrol. The minimum inhibitory concentration (MIC) of the phenolic compounds was determined by the microdilution technic in plates of 96 cavities, in CALDO TSB + 0,5% of Tween 80. The final concentrations (%) obtained were: 0,06; 0,12; 0,24; 0,49; 0,98; 1,95; 3,9; 6,25; 12,5; 25; 50.The patronized bacterial suspension was inoculated into the captivities of the plates, and incubated at 37°C for 24 hours with posterior reading of the absorbance at 620 nm and determination of the MIC. The adaptation of the cells of L. monocytogenes to the eugenol and carvacrol was made through the cultivation of the cells in TSB + 0,06% of eugenol or carvacrol at 37°C for 2 hours. The sample was then centrifuged and the cells were re-suspended and patronized in TSB. After that, the microdilution technic was performed one more time. The obtained results revealed that the L. monocytogenespresented adaptation and cross adaptation to the eugenol and carvacrol. The eugenol and carvacrol CMI was at 24%. The pre-exposition of L. monocytogenes to sub-lethal doses of 0,06% of eugenol or carvacrol enhanced its resistance. The pre-exposition to carvacrol promoted the adaptation of L. monocytogenes to it thus increasingthe MIC to 12,5%. To the eugenol the CMI got to 25%. When submitted to sub-lethal concentrations of eugenol, the latterpromoted the adaptation of the cells to carvacrol and eugenol, bringing the CMI to 12,5%. The obtained results showed that theL. monocytogenespresented adaptation and cross adaptation to the eugenol and carvacrol. The current work suggests future studies even broader regarding the antimicrobial potentialityof these compounds.

Detecção de Listeria monocytogenes pela técnica de PCR em leite contaminado artificialmente / Detection of Listeria monocytogenes by PCR in artificially contaminated milk samples

Avaliou-se a técnica de PCR como opção para reduzir o tempo de detecção de Listeria monocytogenes no leite. Para tanto, amostras de leite desnatado esterilizado e de leite cru integral - com baixa, média e alta contagem de microrganismos aeróbios mesófilos - foram inoculadas experimentalmente com diversas concentrações de L. monocytogenes. Os resultados da reação de PCR foram comparados com os da cultura da amostra empregando-se metodologia padronizada tradicional. Não se detectou L. monocytogenes pela reação de PCR quando esta foi realizada a partir do caldo de enriquecimento de Listeria (LEB) após 24 horas de incubação, nem no leite desnatado esterilizado, nem no leite cru integral. Após 48 horas de enriquecimento em LEB, a bactéria foi detectada por PCR nas amostras de leite desnatado esterilizado, com a sensibilidade de 1UFC/mL, mas não nas amostras de leite cru integral. Pela metodologia tradicional, a bactéria foi recuperada de todos os ensaios. Entretanto, nas amostras de leite cru com altas contagens de aeróbios mesófilos, a sensibilidade da metodologia tradicional foi reduzida (a partir de 7UFC/mL). Melhores resultados foram obtidos quando a reação de PCR foi feita utilizando-se DNA obtido diretamente da colônia suspeita em meio sólido (Oxford e Palcam). Foi possível substituir os testes fenotípicos de identificação de L. monocytogenes pela técnica de PCR reduzindo-se o tempo de identificação da bactéria de vários dias para algumas horas.

The polymerase chain reaction (PCR) was used to detect Listeria monocytogenes in inoculated milk samples after selective enrichment. Samples of sterile skim milk and raw whole milk (with low, intermediate, and high counts of aerobic mesophilic microorganisms) were inoculated with several concentrations of L. monocytogenes. The results of PCR assays were compared to the results of culturing the samples using a standardized traditional method for isolation of L. monocytogenes. The pathogen was detected by PCR in Listeria Enrichment Broth (LEB) after 48h-incubation (sensitivity of 1CFU/mL) but not after 24h-incubation from the samples prepared with sterile skim milk. L. monocytogenes was not detected by PCR in LEB after 24 and 48h-incubation from the samples prepared with raw whole milk. Using the traditional method, the pathogen was detected in all experiments. However, sensitivity decreased in raw whole milk with high counts of aerobic mesophilic microorganisms (up to 7CFU/mL). Best results were obtained when PCR was done to identify presumptive L. monocytogenes colonies directly from Palcam and Oxford media, after the enrichment step. This procedure allowed reducing to a few hours the period of several days usually needed to obtain the final identification of L. monocytogenes using phenotypic tests.